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細(xì)胞培養(yǎng)瓶是貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常用的工具，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)涉及到細(xì)胞的傳代操作。我們?cè)撊绾螌①N壁細(xì)胞進(jìn)行傳代呢？可以按以下步驟操作：

1.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

2. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意細(xì)胞培養(yǎng)瓶取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞。

3. 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入超凈工作臺(tái)后打開瓶口，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

4. 加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用 PBS 清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞較好好，消化溫度是 37℃。

5. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

6. 棄去胰蛋白酶液，加入新鮮的培養(yǎng)液終止反應(yīng)。小心吹打成細(xì)胞懸液。

7. 將細(xì)胞懸液吸入 10 ml 離心管中。平衡后將離心管放入離心機(jī)中，以 1000 rpm/min 離心 5 min。

8. 棄去上清液，加入適當(dāng)體積的培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。

9. 將細(xì)胞懸液吸出分裝至 2 - 3 個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

10. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要時(shí)計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于 5×105 /ml。最后要做好標(biāo)記。

11. 繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入 CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞 2 - 4 h 后開始貼附在瓶壁上。

細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞傳代涉及到細(xì)胞的消化，我們要注意控制好消化時(shí)間，避免因?yàn)橄^度，對(duì)細(xì)胞造成損傷。